笹井芳树:培养皿中长出视网膜

       科学家已经可以诱导干细胞形成视网膜,这为很多眼疾患者带来希望。
       在子宫里,一团相同的细胞分化成各种不同的模样,最终形成高度有序的结构,组装成人体的全副器官。这个过程依照内在的“生物学蓝图”有条不紊地进行,引导组织产生折叠、皱褶,精确形成适当的外形和大小。
       科学家很熟悉这个由简单到复杂的进程,他们一直在思索胚胎发育的机制,暗自惊叹它的奥妙,又渴望在实验台上重演早期发育阶段——既为了更好地理解其中的生物学机制,也为了将这些信息应用于修复和替代受损组织。这个时刻或许已到来了。解密发育奥妙的工作最近取得了不少成就,体外培养的替代器官有望在10年内就进入手术室。
       我之所以作出如此乐观的预测,是因为我的实验室近来在干细胞研究上取得了一些成果。干细胞会分化成其他类型的细胞。我们发现,即使在体外培养的环境下,干细胞也可以分化形成视网膜——眼睛里的关键结构之一,它把来自外部世界的光信号,转换成电信号和化学信号,继而传递给大脑的其他部位。此外,我和同事还培植出了皮层组织,以及垂体的一部分。由于我们对人体信号传导系统的认识越来越深入,因此在做上述研究时,我们根据自己掌握的知识,对培养皿中的一层相互分离的细胞进行诱导,让它们形成了一种轮廓分明的三维结构。其实,这些细胞收到我们“输入”的化学信号后,自己就会行动起来,开始建造视网膜。这一研究成果让很多人看到了希望:用这种方法制备的视网膜组织有望用于治疗黄斑变性等多种眼疾。

培养皿中的奇迹
       刚开始尝试“培养”视网膜时,我们实验室还在探讨视网膜形成的一些基本问题。我们知道,视网膜是从胎儿大脑中名为“间脑”(diencephalon)的那一部分发育而来的。在胚胎发育的早期阶段,间脑的一部分会扩展,形成气球状的视泡(optic vesicle),后者再向内凹陷,形成视杯;视杯进一步形变,最终成为视网膜。
       一个多世纪以来,生物学家一直就视杯形成的精确机制争论不休,直到今天,研究大脑发育的科学家仍然各执一词。其中一个较有争议的问题是,在视杯形成过程中,与之相邻的一些结构,如晶状体和角膜起了什么作用?有些科学家认为,视网膜向内凹陷,是因为受到了晶状体的物理推动作用;也有科学家认为,视杯无须借助晶状体的作用,就可以自己形成。
       要想在活着的、正在发育中的动物身上观察这一现象绝非易事,因此大约在10年前,我的研究团队决定做一次尝试,看能不能把眼睛的发育过程“提取”出来。
       具体做法是,先在培养皿中培养胚胎干细胞,然后加入眼睛发育所需的化学物质,观察培养皿中发生的情况。从发育程度上来说,胚胎干细胞是最原始的干细胞,最终可以分化成从神经到肌肉的各种组织。
       当时,把干细胞培育成器官的技术尚不存在。人们曾把相互分离的干细胞“撒”在膀胱或食管形状的人工骨架上,试图搭建出新的器官。这类组织工程学技术在培植真实器官方面并不是很成功。
       因此,我们决定另辟蹊径。在正式动手之前,我们做了一些准备工作。2000年,我们发明了一种细胞培养方法,可以把小鼠的胚胎干细胞转变成多种神经细胞。随后,我们在培养皿中培养了一层小鼠胚胎干细胞,并加入一些可充当“传递员”的细胞——这些细胞会向胚胎干细胞传递化学信号,促使后者发育、分化,脱离胚胎状态。我们培养这些细胞的目的,并不是要复制某个人体器官的三维结构,而是想看看,仅用细胞自身的化学信号,是否足以让胚胎干细胞形成眼睛发育早期所独有的神经细胞。
       起初,我们没有获得多大的成功,但在2005年,我们在技术上取得了突破。以前,我们实验室在培养干细胞时,细胞只能平铺在培养皿上,但在2005年,我们突破了“二维限制”,可以让干细胞悬浮在培养液中,这就是“悬浮培养”。我们采用这种三维培养技术的原因有很多。首先,在悬浮培养中,细胞聚集时,本身就会形成三维结构,因此在产生复杂组织时,会比平铺的细胞层更容易;其次,为了发育成复杂的结构,细胞之间需要相互交流,而三维培养更适于促进这样的交流,因为细胞之间可以更加灵活地发生相互作用。
       使用这种新方法,我们把相互分离的胚胎干细胞悬浮在液体培养基中,然后注入多孔培养皿的小孔中(每个小孔只有微量的培养基,含大约3 000个胚胎干细胞)。我们发现,原本分开的胚胎干细胞开始聚集在一起。
       随后,就可以诱导这些微小的细胞聚集体,让它们全部分化为一种神经前体细胞(neural progenitor)——这类细胞通常存在于大脑前部。然后,这些细胞开始相互发送信号,经过三四天的时间,它们便自发组织成中空的球体,由单层的神经上皮细胞构成(神经上皮细胞即神经干细胞,由前体细胞分化而来)。我们把这种形成单细胞层的方法称作SFEBq培养法,即“胚状体样聚集体的快速再聚集无血清悬浮培养法”(serum-free floating culture of embryoid body-like aggregate with quick reaggregation)。
       在胚胎中,神经上皮细胞接收来自细胞外的化学信号,最终形成特异的大脑组织结构。在这些化学信号中,有一种信号可触发间脑的发育,形成视网膜和下丘脑(hypothalamus,控制食欲和其他许多基本生理功能的脑区)。成功地使胚胎干细胞形成球体之后,我们实验室开始尝试,诱导这些细胞分化成视网膜前体细胞——成熟视网膜细胞的前体。我们向SFEBq培养体系中加入了一系列蛋白质。在胚胎中,这些蛋白的作用正是诱导视网膜前体细胞的产生。
       当这些细胞球体在悬浮培养基中继续保存了数天之后,视网膜上皮组织自发地向外突出,形成视泡样的结构。然后,突起部分的顶端又开始内陷,形成酒杯状结构,很像胚胎上眼睛的视杯。与活体动物中一样,这个源自胚胎干细胞的视杯也由内外两层组成:外壁是上皮层,内壁便是视网膜。
       换句话说,在培养皿中,原本分开的干细胞组成的聚集体,独自形成了有序的结构——真是名副其实的“eyepopping”(这个词有双关含义,从字面上理解,就是“眼睛出现”,而这个词本身的含义是“使人瞠目的”)。不像在胚胎中,培养皿中并没有晶状体和角膜。这一发现清楚地回答了那个存在已久的问题:原始视网膜的形成,是否需要晶状体等邻近组织施加外部作用力。至少在体外,视网膜的形成是一个基于细胞内部程序的自发现象。
 
眼睛的形成
       由一小块胚胎组织发育成眼睛,会经历如下步骤:内部的神经上皮层向外凸起,形成视泡(第9天);凸起部分的外层向内凹陷(第9.5天),晶状体泡随之形成(第10天);视泡的一部分发生折叠,形成视杯,与晶状体泡共同形成视网膜、视神经及最外部的晶状体(第10.5天)。视网膜包括三个不同的细胞层:视杆和视锥细胞;水平、双极和无长突细胞;视神经节细胞。

眼睛发育的再现
       培养皿中,眼睛的发育过程继续进行着,就像我们在胚胎发育中所看到的一样。我们让视杯在悬浮培养体系中又呆了两个星期,组织的直径大约长到了2毫米,而且与胚胎中一样,单层的视网膜上皮也演变成了层级结构,含有所有6种可在初生婴儿的眼睛中检测到的细胞。
       这一层级结构的外层是光感受器细胞层,最内层是神经节细胞,这类细胞在机体中的作用是连接视网膜与大脑。如同你在真实视网膜中看到的一样,在内外两层之间是几层连接层,由中间神经元(interneuron)构成。与此前一样,多层结构的出现也是依照内在程序完成,这个程序会决定什么细胞应该产生,它们又应该被安排在三维空间的什么位置。
       我们的工作仍未结束。视杯究竟如何形成,一团细胞究竟如何出现规整的结构,这些问题仍然存在。由同一物质构成的团块自发产生复杂形状,这一过程叫做对称破缺(symmetry breaking),贯穿整个胚胎发育过程。如果没有对称破缺,受精卵重复进行细胞分裂只会产生一团未分化的细胞,发育过程会止步不前。我们的自组织胚胎干细胞培养体系似乎可以作为一个理想的实验平台,来研究哺乳动物胚胎形成过程中的这些玄妙机制。
       另一个还不清楚的问题是,单层的视网膜上皮到底是怎么演变成视杯形状的。总的来说,机械力和组织的刚性控制着上皮组织的形变。通过在体外测定视杯形成过程中上皮不同部分的受力方向和组织刚性,我们发现,形成这一结构需要三个步骤。在这一过程中,视网膜的刚性减弱,柔韧性增加;同时,视网膜与上皮交界处的细胞变成楔形;最后,视网膜因快速扩展而内陷。这三个步骤对视杯的形成至关重要。实际上,当我们把这些与组织的机械性质有关的条件输入计算机模拟程序后,的确出现了我们熟悉的酒杯形状。
 
培养皿中的眼睛
       在培养皿中,诱导胚胎干细胞形成视网膜的过程,扼要地再现了胚胎中眼睛发育的主要步骤。这项技术对基础研究的价值不可估量,同时有助于开发一些疗法,帮助视力减退的患者恢复视力。如下图所示,在加入名为生长因子的分子之后,胚胎干细胞开始聚集;大约5天后,开始形成最原始的视泡。及至第7天,视泡向外凸出;几天后,该结构内陷,形成视杯;到第24天,视网膜的所有层次初具雏形。
应用前景
       听说我们的研究后,人们自然想知道,用小鼠胚胎干细胞所做的工作究竟能否给眼疾患者带来好处。在这个方向上,我们已取得了一些进展。值得一提的是,我的实验室最近刚刚在一篇文章中报道过,我们成功地使人类胚胎干细胞分化成视杯和多层神经组织。我们预计,同样的培养方法也可应用于人类的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)——成熟细胞受到特定刺激后,经过逆转的发育过程,可成为诱导多能干细胞,其行为与胚胎干细胞相似。我们还发明了更好的低温贮存方法,能在液氮中储存由人类胚胎细胞分化成的视网膜组织。
       这些工作都将推动体外培养的视网膜组织应用于医学。例如,我们可以制造人工视网膜,帮助人们研究常见眼部疾病的病理机制,推动新药和基因疗法的研究,逆转视网膜病变。
       全世界有数百万人患有黄斑变性、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)和青光眼(glaucoma),这三种视网膜退行性疾病的患者也许都可以从我们的研究中获益。三种疾病中,发生病变的视网膜细胞层各不相同。在黄斑变性中,由于支撑组织“崩溃”,视网膜上皮的完整性受到影响,光感受器细胞也发生退化,尤其是视网膜中心区域。在视网膜色素变性中,视杆细胞(rod,光感受器细胞的一种)数量一年年逐渐减少,最初也是最常见的症状是“夜盲”,而后来,患者会丧失大部分视野,只剩下一小块中心视野。在青光眼病例中,受损的则是神经节细胞,这类细胞会伸出视神经,把视网膜与大脑后部皮层上的视觉处理中心连接起来。
       黄斑变性可能是这三种疾病中最容易用细胞替代疗法缓解的一种。使用传统培养方法和我们的新方法,人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞都比较容易产生支撑组织的细胞,即视网膜色素上皮细胞,并可从培养基中直接提取出来。美国已开始用这种细胞进行早期小规模临床实验,其他国家也有类似的实验计划。在这些实验中,研究人员会用细针,将干细胞分化成的色素上皮细胞注射到色素上皮和光感受器细胞层之间,至少替代部分受损组织。
       视网膜色素变性的细胞疗法尚需进一步改良才能应用于人类。与传统培养方法不同,我们的新技术可产生一层密集的视杆细胞,适于进行移植,但移植了这种细胞层之后,还需用其他关键手段来提高视力。光感受器细胞不同于简单的上皮支撑组织,需要整合到眼睛的神经回路中;尤其重要的是,光感受器需与另一种感觉细胞——双极细胞——重新形成细胞连接,而我们尚不知道如何有效形成这种连接。若能成功移植光感受器细胞,将有望使视网膜色素变性患者至少恢复部分视力,甚至使晚期患者受益。
       青光眼也许是这三种疾病中最难用细胞疗法治疗的。胚胎干细胞培养固然能够产生这种疗法所需的神经节细胞,但胎儿出生后,视神经的再生长便会受到抑制。神经节细胞发出分支,形成视神经,向大脑传递信号,这些分支称作轴突;迄今为止,人们还没有发现诱导其轴突与其他细胞重新连接的方法。
       比起现有的组织工程学技术,即将细胞安放到皮肤或膀胱形状的骨架上,胚胎干细胞分化成的组织显然要好得多。作为研究者,我们必须谨慎而有耐心地揭示发育中的细胞所隐藏的奥秘——由单个细胞形成眼睛这样的复杂器官,究竟经历了怎样复杂的过程。